Ianuarie – Martie 2024

În această etapă a fost elaborată schema experimentală preliminară, care a inclus stabilirea etapelor de monitorizare a acumulării de lipide, a timpului de cultivare și a condițiilor de incubare, precum și selectarea mediilor specifice pentru inducerea acumulării de lipide. Tulpina Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109 a fost inclusă în colecția Departamentului, iar caracteristicile sale morfologice și fiziologice preliminare au fost determinate. Utilizând sistemul Biolog YT MicroPlates, a fost determinat profilul de asimilare / oxidare a diferitelor surse de carbon disponibile.

Au fost realizate documentele necesare etapei de contractare, precum și documentele și demersurile aferente demarării achizițiilor de consumabile și echipamente. De asemenea, a fost inițiată elaborarea unei bibliografii selective, care cuprinde 20 de titluri relevante privind tehnica EAL și analizele asociate acesteia (tehnici biochimice utilizate pentru monitorizarea etapelor necesare parcurgerii fazelor de creștere oleaginoasă la Y. lipolytica, pe medii specifice EAL). Această listă se află în curs de definitivare, fiind necesară atât expertiza directorului de proiect, cât și analiza celor mai recente publicații din domeniu.

Aprilie – Iunie 2024

A fost realizată optimizarea mediului de cultură EAL și a condițiilor de lucru pentru experimente desfășurate în volume mici. Au fost stabilite elemente ale fluxului experimental pentru obținerea curbei de creștere a tulpinii Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109, iar monitorizarea acesteia a fost continuată prin prelevarea de probe pe o perioadă de 11 zile de la inoculare. Au fost determinați parametrii specifici, incluzând variația pH-ului, densitatea celulară, biomasa, conținutul lipidic (prin metode calitative și cantitative) și aspectul microscopic. În consecință, a fost necesară evaluarea acestor parametri în vederea stabilirii punctelor de control pentru implementarea tehnicii EAL pe medii de cultură limitative.

Iulie – Septembrie 2024

Au fost stabilite protocoalele pentru determinarea cantitativă a lipidelor totale din biomasa obținută în urma cultivării Yarrowia lipolytica în condiții EAL, precum și pentru evaluarea calitativă a acumulării de lipide intracelulare neutre prin microscopie de epifluorescență. De asemenea, a fost dezvoltată o metodă pentru determinarea acidului citric și a glicerolului din mediul de cultură.

A fost realizată adnotarea genomului de referință pentru Y. lipolytica, precum și a unui genom utilizat în literatură pentru analiza transcriptomică a tulpinii ACA-DC 50109, în vederea identificării genelor ortologe implicate în procesul de lipogeneză. Au fost efectuate alinieri de tip BLAST pentru compararea unor secvențe codificatoare cu rol central în acest proces, precum și identificarea secvențelor nucleotidice provenite de la tulpini de Y. lipolytica existente în baza de date NCBI GenBank, pe baza similarității cu secvențele codificatoare adnotate și traduse. În urma acestor analize, a fost generată o bază de date formată din 534 de secvențe nucleotidice asociate lipogenezei la Y. lipolytica.

Au fost testate metode alternative de selecție a clonelor evoluate obținute în condiții de cultivare pe mediu cu 7% sursă de carbon, precum și optimizarea protocoalelor de caracterizare a acestora prin tehnici biochimice și microscopice, în vederea creșterii calității și reproductibilității rezultatelor.

A fost analizată literatura de specialitate pentru stabilirea unui flux de lucru optim de extracție a ADN și ARN de calitate, adecvat secvențierii pe platforme Illumina și Nanopore, precum și pentru identificarea celor mai utilizate programe de procesare a datelor brute de secvențiere și de asamblare în flux hibrid.

Au fost corelate datele experimentale obținute în urma cultivării Yarrowia lipolytica în prezența a 7% glicerol referitoare la conținutul de lipide, proteine, polizaharide și biomasă, precum și gradul de asimilare a sursei de carbon. În paralel, au fost identificați parametri de cultivare care pot influența capacitatea drojdiei roșii oleaginoase Rhodosporidium toruloides de a acumula concomitent triacilgliceroli și carotenoizi, și a fost realizată caracterizarea morfo-fiziologică a tulpinii parentale Rhodosporidium toruloides NRRL-Y-27012 din perspectiva toleranței la stres osmotic și ionic, precum și a capacității de asimilare a diferitelor surse de carbon. De asemenea, au fost identificate metode de cuantificare a conținutului de carotenoizi, respectiv profilul chimic al acestora, compatibile cu determinările utilizate pentru monitorizarea conținutului de lipide intracelulare. De asemenea, literatura și bazele de date de specialitate au fost studiate privind datele genomice disponibile pentru R. toruloides și cele mai bune practici de analiză a datelor de secvențiere.

În cazul genului Cunninghamella, au fost identificate studii privind capacitatea de utilizare a surselor de carbon derivate din deșeuri agro-industriale și producerea de acizi grași polinesaturați, precum și metodele frecvent utilizate pentru izolarea și purificarea acizilor nucleici din fungi filamentoși, atât prin kituri comerciale, cât și prin protocoale in-house. Au fost stabilite repere metodologice pentru atenuarea dificultăților asociate prelucrării probelor de micelii de fungi filamentoși și aplicării tehnicilor de colorație specifice microscopiei de epifluorescență pentru evidențierea corpilor lipidici.

Octombrie – Decembrie 2024

Ianuarie – Martie 2025

Echipamentele au început să fie livrate, iar laboratoarele au început să capete contur. Au fost repoziționate echipamentele existente pentru a face loc celor noi și au fost optimizate fluxurile de lucru în laborator, în vederea facilitării activităților studenților și cercetătorilor și creșterii accesibilității la anumite echipamente.

Au fost testate protocoale de izolare a ADN-ului genomic din tulpina parentală Y. lipolytica, cu atenție deosebită acordată etapelor de pretratament anterior lizei celulare, pentru obținerea unor probe cu puritate crescută. A fost stabilit protocolul de lucru pentru monitorizarea și desfășurarea rundelor de evoluție adaptativă în laborator (EAL) pentru R. toruloides, în funcție de sursa de carbon selectată și de metoda de presiune selectivă aplicată. De asemenea, a fost definită o metodă de conservare a clonelor evoluate obținute în cadrul procesului EAL, inclusiv a populațiilor de clone evoluate, caracterizate prin creșterea proporției de ce sedimentează dificil în urma centrifugării. Au fost testate condițiile EAL în conformitate cu particularitățile tulpinii Cunninghamella echinulata CCF 2591 și au fost determinate metode optime de selecție a sporilor cu conținut lipidic ridicat. Totodată, au fost inițiate cultivări preliminare ale R. toruloides la scară de bioreactor de laborator, utilizând surse de carbon pure, pentru stabilirea parametrilor biotici și abiotici necesari tranziției de la cultivări de tip batch shake-flask la culturi controlate în bioreactor. A fost realizată selecția și procesarea preliminară a reziduurilor agro-industriale cu potențial de conversie eficientă în lipide intracelulare neutre.

În paralel, au fost elaborate rapoarte de progres pentru activitățile aflate în desfășurare, concomitent cu recepția echipamentelor, instalarea acestora, instructajul personalului și reorganizarea spațiului de lucru.

A avut loc o vizită de lucru a domnului Prof. Georgios Angelis, în perioada 3-6 februarie, concretizată prin discuții științifice și analiza rezultatelor obținute. De asemenea, au fost depuse și acceptate trei rezumate (abstracte) pentru prezentări de tip poster la conferințe științifice internaționale.

A fost stabilită o strategie de identificare a agenților economici cu profil de activitate relevant la nivel național și european, fiind realizată o listă preliminară de potențiali agenți colaboratori din domeniul biotehnologiei microbiene sau al producerii de reziduuri agro-industriale.

Aprilie – Iunie 2025

Pe parcursul experimentelor EAL aplicate pe Y. lipolytica au fost izolate trei clone evoluate, conservate la -80 °C, care, în urma caracterizării, au demonstrat o capacitate crescută de lipogeneză. A fost realizată determinarea preliminară a profilului lipidic și a ultrastructurii celulare a tulpinii parentale prin analize cromatografice și microscopie electronică de transmisie. A fost efectuată izolarea ADN din probe ale tulpinii parentale Y. lipolytica ACA-DC 50109, urmată de secvențierea acestuia prin tehnologia short-reads Illumina. Datele obținute au fost asamblate și analizate, iar secvențele codificatoare au fost adnotate utilizând baze de date de tip Gene Ontology (KEGG, EggNOG), pentru identificarea genelor implicate în lipogeneză, ciclul Krebs și glicoliză. În paralel, au fost testate mai multe variante de protocol pentru izolarea ARN, fiind selectată varianta optimă pentru analize ulterioare. De asemenea, a fost realizată adnotarea genomului asamblat al tulpinii Y. lipolytica ACA-DC 50109 în vederea identificării secvențelor codificatoare relevante.

A fost stabilit și optimizat protocolul de lucru pentru experimentele EAL pe R. toruloides, prin adaptarea parametrilor în funcție de fenotipul oleaginos specific tulpinii. Au fost caracterizate populațiile de clone obținute după opt runde de evoluție, fiind selectate trei clone evoluate, conservate la -80 °C, prin cultivare pe mediu fără sursă de carbon. Acestea au fost ulterior caracterizate din punct de vedere al fenotipului de lipogeneză și al profilului biochimic. A fost realizată izolarea ADN, secvențierea și asamblarea genomului tulpinii parentale R. toruloides NRRL-Y-27012, precum și testarea mai multor variante de protocol pentru izolarea ARN.

În paralel, a fost inițiat și derulat experimentul EAL pe C. echinulata, prin parcurgerea primelor trei runde evolutive în două linii diferențiate prin raportul C/N. Au fost obținute date experimentale privind protocoalele de izolare ADN și ARN testate pe tulpina parentală C. echinulata CCF 2591, fiind selectate metodele optime pentru obținerea probelor de calitate adecvată secvențierii. A fost analizată modificarea caracteristicilor structurale celulare pentru clonele evoluate conservate la -80 °C. De asemenea, a fost realizată secvențierea tulpinii parentale de C. echinulata prin tehnologia Illumina, urmată de controlul calității și asamblarea datelor. A fost evaluată capacitatea de acumulare a biomasei în prezența unor surse alternative de carbon derivate din reziduuri agro-industriale, precum și eficiența conversiei acestora în lipide intracelulare neutre.

Au fost elaborate rapoarte de progres pentru activitățile aflate în desfășurare, concomitent cu recepția, instalarea și instructajul privind utilizarea echipamentelor. Rezultatele proiectului au fost prezentate în cadrul conferinței ASM Microbes 2025 (Los Angeles, SUA), precum și în cadrul Sesiunii Studențești de Comunicare Științifică a Universității din București, de către studenții doctoranzi și masteranzi implicați. În final, a fost realizată o listă detaliată de agenți economici la nivel național și european, incluzând informații privind profilul de activitate, site-ul web și țara de origine.