ianuarie – martie 2024
În această etapă s-a realizat schema experimentală preliminară, ce a presupus stabilirea: etapelor de monitorizare a acumulării de lipide; a timpului de cultivare și a condițiilor de incubare respectiv, selectarea mediilor specifice pentru inducerea acumulării de lipide. S-a inclus în colecția Departamentului tulpina Y. lipolytica ACA-DC 50109 și s-au determinat caracteristicilor morfologice și fiziologice preliminare a tulpinii. Cu ajutorul Biolog YT MicroPlates, s-a determinat profilul de asimilare sau de oxidare a diferitelor surse de carbon disponibile.
Au fost realizate documente necesare etapei de contractare, cât si documente si demersuri pentru demararea achizițiilor de consumabile dar si de echipamente. S-a inițiat realizarea unei bibliografii selective care cuprinde 20 titluri bibliografice privind: tehnica EAL; analize asociate experimentului EAL (tehnici biochimice care permit monitorizarea etapelor necesare parcurgerii fazelor de creștere oleaginoase la Y. lipolytica pe medii specifice pentru EAL). Această listă este în curs de selecție deoarece este necesară atât experiența directorului de proiect cât și analiza ultimelor publicații apărute pe tema proiectului.
aprilie -iunie 2024 Prima întâlnire de grup cu toți membrii echipei-coordonare Prof dr. George Aggelis
Optimizarea mediului de cultură EAL și a condițiilor de lucru pentru experimente derulate în volume mici. S-au stabilit elemente ale fluxului de desfășurare a unei curbe de creștere a tulpinii Y. lipolytica ACA-DC-50109 și s-a continuat cu monitorizarea curbei de creștere prin prelevarea de probe timp de 11 zile de la inoculare; determinare parametrii: variație pH, densitate celulară, biomasă, conținut lipidic (metode calitative și cantitative), aspect microscopic. Ca urmare, a fost necesară evaluarea parametrilor obținuți în vederea stabilirii punctelor de control pentru implementarea tehnicii EAL pe mediu de cultură limitativ.
iulie-septembrie 2024
Stabilirea protocolului de determinare cantitativă a lipidelor totale din biomasa rezultată în urma cultivării Y. lipolytica în condiții EAL; Stabilirea unei metode pentru determinarea acidului citric și glicerolului din mediul de cultură; Stabilirea protocolului de evaluare calitativă a acumulării de lipide intracelulare neutre în celule de Y. lipolytica prin microscopie de epifluorescență; Adnotarea genomului de referință pentru Y. lipolytica și un genom folosit în literatură pentru analiza transcriptomică a tulpinii ACA-DC 50109 în vederea identificării genelor ortologe asociate cu procesul de lipogeneză. Compararea prin alinieri de tip BLAST a unor secvențe codificatoare cu rol central în proces; Identificarea secvențelor nucleotidice provenite de la tulpini de Y. lipolytica existente în baza de date NCBI GenBank, în baza similarității față de secvențele codificatoare adnotate și traduse. Generarea unei baze de date de 534 secvențe de nucleotide asociate cu procesul de lipogeneză la Yarrowia lipolytica.
Testarea metodelor alternative de selecție a clonelor evoluate obținute în urma cultivării pe mediu cu sursă de carbon 7%; Eficientizarea protocoalelor de caracterizare a clonelor evoluate prin tehnici biochimice și de microscopie prin creșterea calității și reproductibilității rezultatelor obținute; Analiza literaturii în vederea stabilirii unui flux de lucru pentru izolarea de ADN și ARN de calitate potrivită pentru secvențierea pe platformele Illumina și Nanopore. Identificarea programelor preferate în momentul actual în literatura de specialitate pentru prelucrarea datelor brute de secvențiere și asamblarea în flux hibrid; Corelarea datelor experimentale obținute în urma cultivării Y. lipolytica în prezență de glicerol 7% privind conținutul de lipide, proteine, polizaharide și biomasă, precum și asimilarea sursei de carbon; Identificarea parametrilor de cultivare care pot influența capacitatea tulpinii de R. toruloides de a acumula concomitent triacilgliceroli și compuși carotenoidici; Caracterizarea morfo-fiziologică a tulpinii parentale de R. toruloides NRRL-Y-27012 din perspectiva capacității de a tolera stres osmotic și ionic, precum și de a asimila diferite surse de carbon; Identificarea unor metode de cuantificare a conținutului de carotenoizi, respectiv profilul chimic al acestora, compatibile determinările folosite pentru monitorizarea conținutului de lipide intracelulare. Analiza literaturii și bazelor de date de specialitate în vederea identificării datelor genomice existente pentru R. toruloides, precum și cele mai bune practici pentru analiza datelor de secvențiere; Identificarea în literatura de specialitate a unor studii cu privire la capacitatea tulpinilor din genul Cunninghamella de a asimila surse de carbon derivate din deșeuri agro-industriale și de a produce acizi grași polinesaturați; Identificarea in literatura de specialitate a metodelor adecvate și utilizate cel mai frecvent pentru izolarea și purificarea acizilor nucleici din culturi de fungi filamentoși, utilizând atât kit-uri comerciale cât și protocoale in-house; Stabilirea unor repere metodologice referitoare la principalele strategii de atenuare a dificultăților asociate prelucrării de probe de micelii de fungi filamentoși în aplicarea tehnicilor de colorație specifice microscopiei de epifluorescență cu rol de evidențiere a corpilor lipidici.
octombrie 2024-decembrie 2024
Echipa Evosco s-a mărit: au fost ocupate 2 posturi de doctoranzi de catre drd. Lecu Ana-Maria Alexandra și drd. Georgescu Ana-Maria dar și 2 pozitii parțiale de post doctorand dr. Avram Ionela și dr. Irina Gheorghe-Barbu. Zece clone evoluate obținute în urma unui proces EAL ce utilizează glucoză drept sursă de carbon și ca metodă de selecție, cultivarea pe mediu fără sursă de carbon au fost conservate pe termen lung la -80 °C. A fost realizată o caracterizare a clonelor evoluate obținute în A1.1, utilizând tehnici de microscopie, precum și analize chimice și biochimice ale biomasei și ale mediului de cultură. A fost realizat un flux de lucru pentru obținerea și prelucrarea datelor de secvențiere genomică și transcriptomică pentru tulpina parentală de Y. lipolytica. Adaptarea unui protocol pentru colorația cu fluorocromul Nile Red și analiza calitativă a acumulării de lipide la R. toruloides prin microscopie de epifluorescență. Adaptarea metodei de extracție și purificare a lipidelor acumulate de R. toruloides în urma cultivării pe mediu EAL. Validarea metodelor de monitorizare a asimilării sursei de carbon din mediul EAL. Realizarea fluxului de lucru pentru adnotarea datelor de secvențiere. Stabilirea unui plan experimental pentru determinarea parametrilor necesari implementării tehnicii EAL folosind tulpina C. echinulata CCF 2591 în prezența substraturilor selectate din literatura de specialitate.
ianuarie 2025-martie 2025
Echipamentele au început să vie livrate și laboratoarele au început să capete contur. Au fost repozitionate echipamentele deja existente, pentru a face loc celor noi, au fost optimizate fluxurile în laborator asfel încât să ușureze dinamica studenților și cercetătorilor în laborator, și pentru a crește accesibilitatea la anumite echipamente. Au fost testate protocoale de izolare ADNgenomicdin tulpina parentală Y. lipolytica, cu atenție acordată etapelor de pretratament anterior lizei celulare, în vederea obținerii unor probe cu puritate crescută. A fost stabilit protocolul de lucru pentru monitorizarea și perpetuarea rundelor EAL pentru R. toruloides, în baza sursei de carbon alese și metodei de presiune selectivă selectată. Alegerea unei metode de conservare a clonelor evoluate obținute din cadrul procesului EAL. Conservarea unor probe reprezentate de populațiile de clone evoluate existente la momentul observării unei creșterei în proporția de celule ce sedimentează dificil în urma centrifugări. Testarea condițiilor EAL în conformitate cu particularitățile tulpinii C. echinulata CCF2591 și determinarea metodelor optime de selecție a sporilor cu conținut lipidic ridicat. Inițierea cultivărilor preliminare a R. toruloides la scară de bioreactor de laborator, utilizând surse de carbon pure, pentru stabilirea parametrilor biotici și abiotici necesari tranziției de la cultivări batch shake-flask.
